Nguyễn Thị Minh Anh _ CVPH _IVFMD TÂN BÌNH

  1. Giới thiệu

Trong những năm gần đây, do các yếu tố thực tế như chi phí và khả năng cung ứng toàn cầu, sự phát triển và thay thế các kỹ thuật cũ, khái niệm “universal warming” (rã đông phổ quát) ngày càng được quan tâm trong thực hành hỗ trợ sinh sản. Universal warming đề cập đến khả năng phôi đã được thủy tinh hóa bằng một hệ môi trường của nhà sản xuất này nhưng có thể rã bằng môi trường của nhà sản xuất khác mà vẫn đảm bảo tỷ lệ sống và kết quả lâm sàng tương đương. Xu hướng số ca phôi có thể được đông lạnh và rã đông bằng các bộ kit thương mại từ các hãng khác nhau thành phần và nồng độ đường ngày càng gia tăng [1], [2]. Việc thực hành đông lạnh và rã đông với nhiều hệ môi trường kết hợp phương pháp rã đơn bước giúp đơn giản hóa hoạt động trao đổi phôi/noãn đã thuỷ tinh hoá giữa các trung tâm hỗ trợ sinh sản hỗ trợ cho những nhu cầu và mong muốn khác nhau của bệnh nhân, đồng thời khắc phục những khác biệt về quy định pháp lý, thương mại và khả năng cung ứng có thể ảnh hưởng đến thực hành lâm sàng [3].

  1. Hiệu quả của kĩ thuật

Phương pháp này lần đầu tiên được báo cáo bởi bởi Parmegiani L và cộng sự (2014), mục tiêu của nhóm nghiên cứu là thiết kế một bộ kit để rã đông với nồng độ các chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotective Agents – CPA) không thẩm thấu giảm dần nồng độ 1M/0,5M cho các trường hợp đông lạnh chậm bằng nhiều hệ môi trường khác nhau trong bối cảnh phôi/noãn được vận chuyển giữa các trung tâm và không có sẵn kit rã đông cho các trường hợp này. Tổng cộng 216 noãn người đông lạnh bằng phương pháp đông lạnh chậm được chia thành 2 nhóm: nhóm 1 rã đông với quy trình thường quy và nhóm 2 ra đông nhanh với môi trường rã đông của thuỷ tinh hoá. Tiêu chí chính là đánh giá tỷ lệ sống sau 2 giờ rã đông. Sau đó, các noãn sống được chia thành hai nhóm nhỏ: (i) trinh sản (parthenogenesis) và (ii) cố định để quan sát cấu trúc thoi vô sắc và nhiễm sắc thể. Các tiêu chí phụ bao gồm khả năng phát triển sau trinh sản và cấu trúc thoi vô sắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của noãn ở nhóm rã đông nhanh bằng môi trường của thuỷ tinh hoá cao hơn so với rã đông thông thường (90,2% so với 74,6%; P = 0,005). Sau 3 ngày nuôi cấy, các noãn được rã đông nhanh có số lượng phôi bào cao hơn so với nhóm rã đông thông thường
(P = 0,042). Cấu trúc thoi vô sắc và sự sắp xếp nhiễm sắc thể không có sự khác biệt ở hai nhóm [4].

Hiệu quả của phương pháp này tiếp tục được xác nhận bởi một nghiên cứu đa trung tâm trên 414 noãn đông lạnh chậm. Các noãn được chia thành 3 nhóm: nhóm A (rã đông thường quy bằng môi trường Origio); nhóm B (rã đông thường quy bằng môi trường CSC); nhóm C (rã đông nhanh bằng môi trường của thuỷ tinh hoá Sage). Kết cục chính là tỷ lệ sống sau 2 giờ rã đông. Các noãn này sau đó được chia thành 3 nhóm nhỏ: (i) trinh sản (parthenogenesis); (ii) cố định và quan sát bằng kính hiển vi; (iii) quan sát cấu trúc thoi vô sắc. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống của nhóm rã đông nhanh - C (91,6%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với 2 nhóm còn lại A (80,7%); B (60,4%). Không có sự khác biệt giữa tỷ lệ trinh sản và cấu trúc thoi vô sắc ở cả 3 nhóm [5]. Vì noãn là tế bào nhạy cảm nhất với tổn thương do quá trình đông lạnh và rã đông do đó tác giả cho rằng việc áp dụng 1 quy trình rã đông cho mọi loại tế bào bất kể phương pháp đông lạnh nào được sử dụng là khả thi. Đây là 2 nghiên cứu tiền đề để nhóm tác giả tiếp tục phối hợp nhiều hệ môi trường với nhiều phương pháp trữ đông và nhiều dòng tế bào khác nhau.

Nghiên cứu tiếp theo được công bố năm 2018 tiếp tục thử nghiệm phối hợp nhiều hệ môi trường với nhau trên nhóm phôi nang được trữ bằng phương pháp thuỷ tinh hoá và chia thành 2 giai đoạn. Giai đoạn 1 thực hiện tiến cứu trên 315 phôi nang được thuỷ tinh hoá và chia thành 4 nhóm: nhóm A (thuỷ tinh hoá bằng môi trường Kitazato và rã đông bằng môi trường Kitazato); nhóm B (thuỷ tinh hoá bằng môi trường Kitazato và rã đông bằng môi trường Sage); nhóm C (thuỷ tinh hoá bằng môi trường Sage và rã đông bằng môi trường Kitazato); nhóm D (thuỷ tinh hoá bằng môi trường Sage và rã đông bằng môi trường Sage). Tỷ lệ sống và tỷ lệ phôi làm tổ được ghi nhận. Tỷ lệ sống sau rã của phôi nang của 4 nhóm lần lượt là nhóm A 99,0%; nhóm B 98,8%; nhóm C 98,6%; nhóm D 98,6% và tỷ lệ làm tổ lần lượt là nhóm A 18,8%; nhóm B 18,1%; nhóm C 18% và nhóm D 22,5%. Giai đoạn 2 thực hiện hồi cứu trên 1055 phôi phân chia (847 phát triển từ noãn tự thân và 208 phát triển từ noãn hiến tặng) trong đó phôi được đông lạnh, rã đông bằng 3 loại môi trường khác nhau (Kitazato - K, Sage - S và môi trường tự pha – H) và chia thành các nhóm sau: nhóm KK (đông lạnh bằng Kitazato và rã đông bằng Kitazato); nhóm KS (đông lạnh bằng Kitazato và rã đông bằng Sage); nhóm SK (đông lạnh bằng Sage và rã đông bằng Kitazato); nhóm SS (đông lạnh bằng Sage và rã đông bằng Sage); nhóm SH (đông lạnh bằng Sage và rã đông bằng môi trường tự pha); nhóm HK (đông lạnh bằng môi trường tự pha và rã đông bằng môi trường Kitazato); nhóm HS (đông lạnh bằng môi trường tự pha và rã đông bằng môi trường Sage); nhóm HH (đông lạnh bằng môi trường tự pha và rã đông bằng môi trường tự pha). Tỷ lệ sống sau rã của nhóm phôi từ noãn tự thân lần lượt là KK 96,4%; KS 100,0%; SK 98,8%; SS 97,2%; SH 97,6%; HK 95,2%; HS 99,5% và HH 97,4%. Tỷ lệ sống sau rã của nhóm phôi từ noãn hiến tặng lần lượt là KK 100,0%; KS 98,4%; SK 100,0% và SS 96,7%. Tỷ lệ phôi làm tổ không có sự khác biệt giữa các nhóm. Nghiên cứu này giúp chứng minh một cách có hệ thống tính khả thi khi áp dụng trên lâm sàng của việc kết hợp các hệ môi trường với nhau. Với việc sử dụng môi trường rã đông với nồng độ CPA giảm dần nồng độ cho phép một quy trình rã hiệu quả bất kể phôi được đông lạnh bằng hệ môi trường nào. Điều này giúp tối ưu hoá chi phí, đơn giản hóa các quy trình phòng thí nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi noãn/phôi giữa các trung tâm hỗ trợ sinh sản (HTSS) [6].

            Nghiên cứu tiếp theo nhóm tác giả Parmegiani L và cộng sự (2019) tiếp tục ứng dụng  trên noãn người nhằm chứng minh có thể tối ưu hoá quá trình đông lạnh vã rã đông noãn trong các trường hợp bệnh nhân mong muốn vận chuyển giao tử của mình qua các quốc gia khác nhau. Đây là nghiên cứu hồi cứu thực hiện trên 238 bệnh nhân, trong đó noãn được đông lạnh tại Tây Ban Nha sau đó vận chuyển qua trung tâm khác tại Ý để thực hiện ICSI. Tổng cộng 1898 noãn được chia thành 2 nhóm: nhóm 1 (noãn được trữ bằng môi trường Kitazato và rã đông bằng môi trường Kitazato – KK); nhóm 2 (noãn được trữ bằng môi trường Kitazato và rã đông bằng môi trường Irvine – KI). Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống của noãn tương đương ở 2 nhóm 84,6% - KK và 82,1% - KI. Tỷ lệ thụ tinh thấp hơn có ý nghĩa thống kê (P = 0,027) ở nhóm KK (75,7%) so với nhóm KI (80,4%). Tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ sinh sống đều tương đương nhau giữa hai nhóm nghiên cứu: tỷ lệ tạo phôi nang là 58,5% (KK) so với 57,8% (KI); tỷ lệ làm tổ là 41,5% (KK) so với 45,9% (KI); tỷ lệ sinh sống là 52,5% ở nhóm KK và 45,0% (54/120) ở nhóm KI. Kết quả nghiên cứu tiếp tục chứng minh việc sử dụng quy trình “universal warming”  giúp đơn giản hóa việc trao đổi noãn đông lạnh giữa các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở các quốc gia khác nhau, đồng thời khắc phục những khác biệt tiềm tàng về quy định, thương mại và khả năng cung ứng ảnh hưởng đến thực tiễn lâm sàng [7]. Nhóm nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm phương pháp này trên phôi nang với 3 hệ môi trường thương mại là Kitazato, Sage và Irvine. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi sống sau rã, tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ trẻ sinh sống giữa các nhóm khi kết hợp trữ và rã với 3 hệ môi trường trên. Như vậy, việc phối hợp nhiều hệ môi trường trữ-rã không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ trẻ sinh sống. Sự khác biệt về thành phần môi trường không tác động nhiều đến hiệu quả, điều quan trọng là sử dụng đúng chất bảo vệ đông lạnh (CPA), nồng độ và đảm bảo chính xác quy trình thực hiện [3].

Trong những năm gần đây, có nhiều báo cáo về việc tinh gọn quy trình rã đông chỉ dùng 1 loại môi trường TS (Thawing Solution) với đồng độ CPA không thẩm thấu 1M trong 1 phút sau đó chuyển phôi/noãn vào môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu năm 2024 tác giả Liebermann đề xuất quy trình rã đông 1 bước bằng môi trường TS. Phương pháp này dựa trên cơ sở các nghiên cứu thực nghiệm và mô hình in-silico cho thấy phần lớn các CPA được loại bỏ rất nhanh trong bước đầu tiên ở môi trường TS (có CPA không thẩm thấu với nồng độ 1M) và các bước DS (Dilute Solution) (CPA không thẩm thấu nồng độ 0,5M), WS (Washing Solution) là không cần thiết để bảo vệ tế bào khỏi sốc thẩm thấu. Bước phôi tiếp xúc với môi trường TS đóng vai trò then chốt, quyết định đến tỷ lệ sống và khả năng phát triển tiếp theo của phôi. Do đó, việc bỏ bước DS và WS giúp rút ngắn quy trình từ 10 - 15 phút xuống còn 1 - 2 phút, giảm nguy cơ thao tác sai, tăng hiệu quả và đồng nhất quy trình trong phòng lab [8]. Trong quy trình này, dụng cụ chứa phôi sau khi lấy ra từ nito lỏng sẽ nhúng trực tiếp vào 1 giọt 400 µl dung dịch sucrose 1M đã được làm ấm trước đó, đặt trên bàn gia nhiệt ở 38°C và giữ trong thời gian 1 phút. Nhiệt độ của giọt dung dịch được xác nhận là 37°C bằng nhiệt kế. Sau đó, phôi nang được rửa nhanh bằng môi trường nuôi cấy và chuyển sang một giếng khác chứa cùng môi trường cho đến thời điểm chuyển phôi. Với phương pháp rã này, tỷ lệ sống của phôi tương tương, tỷ lệ làm tổ, thai diễn diễn cao hơn trong khi đó tỷ lệ sảy thai thấp hơn so với rã nhiều bước. Sau tổng cộng 3.647 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh - rã đông (Frozen Embryo Transfer - FET), tỷ lệ β-hCG dương tính ở tất cả các nhóm tuổi đạt 71,5%. Bên cạnh đó, quy trình rã 1 bước trong thời gian 1 phút ghi nhận tỷ lệ thai diễn tiến cao (51,7% cho toàn bộ quần thể nghiên cứu; 46,8% đối với phôi chưa xét nghiệm di truyền; và 54,6% đối với phôi nguyên bội), kèm theo tỷ lệ làm tổ cao (lần lượt là 60,4%, 56,0% và 63,2%) và tỷ lệ sảy thai tự nhiên thấp hơn. Tại thời điểm thực hiện nghiên cứu 2.070 chu kỳ FET đầu tiên áp dụng quy trình rã một bước được phân tích. Tổng cộng ghi nhận 1.093 trẻ sinh sống, tương ứng với tỷ lệ sinh sống đạt 52,8%. Trọng lượng sơ sinh trung bình là 3,265 ± 661g và tuổi thai trung bình khi sinh là 37,6 ± 2,4 tuần [9]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ sống sau rã đông trên phôi nang khi thực hiện rã đông 1 bước so với quy trình thường quy không có sự khác biệt dao động khoảng 96-99%. Các tiêu chí đánh giá về sự nở lại của phôi sau 2h và 4h sau rã cũng không có sự khác biệt. Về kết cục lâm sàng cũng cho thấy tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ thai diễn tiến tương đương hoặc có xu hướng cao hơn so với quy trình rã thường quy [10], [11]. Từ những kết quả này cho thấy quy trình rã đơn bước mang lại hiệu quả cao hơn, an toàn hơn cho bệnh nhân đồng thời giúp tiết kiệm thời gian trong thực hành labo và chi phí điều trị.

Việc thực hành đông lạnh và rã đông với nhiều hệ môi trường kết hợp phương pháp rã đơn bước cũng được báo cáo nhưng có rất ít dữ liệu được công bố. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Parmegiani L và cộng sự (2025) thực hiện trên 184 phôi nang được trữ bằng 3 hệ môi trường Kitazato, Sage, Irvine và được rã nhanh 1 bước bằng môi trường TS với các hệ môi trường Kitazato, Sage, Irvine, VitaVitro. Các nhóm đông lạnh và rã đông được kết hợp với nhau bao gồm: USSW-I (rã đông nhanh bằng môi trường Irvine); USSW-K (rã đông nhanh bằng môi trường Kitazato), USSW-S (rã đông nhanh bằng môi trường Sage) và USSW-V (rã đông nhanh bằng môi trường VitaVitro), nhóm đối chứng rã đông bằng môi trường thường quy IFU-S (rã đông bằng môi trường Sage). Kết quả cho thấy, tỷ lệ phôi sống sót sau rã đông dao động từ 99,5% đến 100% và tương đương nhau giữa các nhóm nghiên cứu. Tỷ lệ mang thai lâm sàng và tỷ lệ làm tổ tương đương nhau giữa tất cả các nhóm. Tỷ lệ thai lâm sàng lần lượt ở các nhóm IFU-S (54,5%); USSW-I (38,9%); USSW-K (60%); USSW-S (42,1%) và USSW-V (50%). Tỷ lệ phôi làm tổ lần lượt là IFU-S (46,2%); USSW-I (37,9%); USSW-K (60%); USSW-S (41%) và USSW-V (45,5%) [12]. Báo cáo tiếp theo của cùng nhóm tác giả thực hiện trên 329 phôi nang được trữ đông bằng 3 hệ môi trường Kitazato (K), Sage (S), Irvine (I) và rã 1 bước với 3 hệ môi trường trên. Tổng cộng 9 nhóm đông lạnh và rã đông từ 3 hệ môi trường trên được kết hợp với nhau. Chữ cái đầu tiên biểu thị môi trường đông lạnh và chữ cái thứ 2 là môi trường rã đông. 9 nhóm nghiên cứu được phân chia bao gồm KK, KI, KS, SS, SK, SI, II, IK, IS. Tỷ lệ phôi làm tổ trung bình là 42,3%; tỷ lệ thai lâm sàng 45,2%, tỷ lệ trẻ sinh sống 12,4%, tại thời điểm báo cáo đã có 10 trẻ sinh sống ra đời [13]. Nghiên cứu của tác giả Kato và cộng sự (2025) thực hiện trên 1173 chu kì chuyển phôi nang đông lạnh. Trong đó, phôi được trữ bằng hệ môi trường Reprolife và chia thành 2 nhóm: Nhóm 1 rã theo phương pháp đa bước thường quy bằng môi trường Reprolife; Nhóm 2 rã 1 bước với 3 hệ môi trường khác nhau (Irvine Scientific, Kitazato, Reprolife). Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phôi tái nở rộng sau 4-5 giờ nuôi cấy sau rã ở nhóm đơn bước cao hơn đa bước (92,4% với 86,9%, P=0,0009); tỷ lệ thai diễn tiến ở nhóm rã đơn bước cũng cao hơn đa bước (69,3%% với 61,2%; P=0,0042). Khi phân tích riêng từng nhóm môi trường rã đơn bước không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi tái nở rộng và kết cục lâm sàng [14]. Tại Việt Nam, dữ liệu về rã đơn bước kết hợp “universal warming” còn khá hạn chế, mới chỉ có báo cáo sơ bộ của Luu và cộng sự (2025) trên mô hình phôi hiến tặng. Trong nghiên cứu này tổng cộng 128 phôi nang hiến tặng được thuỷ tinh hoá bằng môi trường Reprolife sau đó chia thành 3 nhóm: nhóm 1 rã thường quy bằng môi trường Reprolife; nhóm 2 rã đơn bước bằng môi trường Warm 1 Blast of RapidWarm Blast kit (Vitrolife); nhóm 3 rã đơn bước bằng môi trường nuôi cấy Sage one-step with HSA (Origio). Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống sau rã không có sự khác biệt ở 3 nhóm, phôi sau rã đông có khả năng nở lại bình thường. Tác giả cho rằng, phương pháp rã đông một bước kết hợp universal warming (one-step warming) có thể được xem là một lựa chọn thay thế tiềm năng cho phương pháp rã truyền thống. Tuy nhiên, cần thêm nhiều nghiên cứu để làm rõ các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phục hồi của phôi và tối ưu hoá quy trình thực hành trong labo [15].

  1. Kết luận

Hiện nay, việc kết hợp nhiều hệ môi trường trữ-rã đang là xu hướng chung của các trung tâm hỗ trợ sinh sản nhằm đáp ứng yêu cầu vận chuyển giao tử qua lại giữa các trung tâm HTSS của bệnh nhân đồng thời giải quyết các vấn đề như chi phí, khả năng cung ứng toàn cầu, sự phát triển và thay thế các kỹ thuật cũ. Đã có nhiều báo cáo chứng minh chiến lược này là khả thi, đảm bảo tỷ lệ sống sau rã, tỷ lệ thai lâm sàng, thai diễn tiến. Bên cạnh đó, kết hợp “universal warming” với phương pháp rã đơn bước sẽ giúp các trung tâm nâng cao hiệu quả điều trị, tiết kiệm thời gian và tối ưu hoá quy trình thực hành trong labo. Tuy nhiên, đây là hướng tiếp cận mới cần thận trọng trước khi áp dụng rộng rãi trên lâm sàng do đó các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn nên được thực hiện để chứng minh hiệu quả và tính an toàn.

 

  1. Tài liệu tham khảo

[1]      C. A. Leisinger, M. T. Pettit, W. B. Schoolcraft, R. Holmes, and J. E. Swain, “one-step warming protocol for vitrified blastocysts results in significant reduction of warming time with no difference in cryosurvival,” Fertil. Steril., vol. 122, no. 4, p. e42, Oct. 2024, doi: 10.1016/j.fertnstert.2024.07.184.

[2]      J. Gunst, M. Vynck, K. Hostens, V. Standaert, S. Roggeman, and A. van de Vijver, “Comparative Assessment of Survival and Clinical Outcome Between Two Commercial Vitrification Kits with Different Warming Protocols After Blastocyst Culture: Potential Perspectives Toward Simplified Warming Procedures,” Reproductive Sciences 2023 30:11, vol. 30, no. 11, pp. 3212–3221, Jun. 2023, doi: 10.1007/s43032-023-01281-1.

[3]      S. Canosa et al., “Are commercial warming kits interchangeable for vitrified human blastocysts? Further evidence for the adoption of a Universal Warming protocol,” vol. 1, p. 3, doi: 10.1007/s10815-021-02364-1.

[4]      L. Parmegiani et al., “Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol?,” Reprod. Biomed. Online, vol. 28, no. 5, pp. 614–623, 2014, doi: 10.1016/j.rbmo.2014.01.015.

[5]      L. Parmegiani et al., “Efficacy and efficiency of the ‘universal warming protocol’: multicenter randomized controlled study on human slow frozen oocytes,” Fertil. Steril., vol. 102, no. 3, p. e122, Sep. 2014, doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.07.419.

[6]      L. Parmegiani et al., “Testing the efficacy and efficiency of a single ‘universal warming protocol’ for vitrified human embryos: prospective randomized controlled trial and retrospective longitudinal cohort study,” J. Assist. Reprod. Genet., vol. 35, no. 10, pp. 1887–1895, Oct. 2018, doi: 10.1007/s10815-018-1276-4.

[7]      L. Parmegiani et al., “‘Universal Warming’ protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study,” J. Assist. Reprod. Genet., vol. 37, no. 6, pp. 1379–1385, Jun. 2020, doi: 10.1007/s10815-020-01798-3.

[8]      I. Martinez-Rodero et al., “Shorter protocols for vitrification and post-warming dilution of human oocytes and embryos: a narrative review,” Reprod. Biomed. Online, vol. 51, no. 2, Aug. 2025, doi: 10.1016/j.rbmo.2025.104857.

[9]      J. Liebermann et al., “Fast and furious: successful survival and resumption of meiosis in immature human oocytes vitrified and warmed using a short protocol,” Reprod. Biomed. Online, vol. 49, no. 1, Jul. 2024, doi: 10.1016/j.rbmo.2024.103976.

[10]    M. Shioya et al., “One-step warming of vitrified human cleavage and blastocyst stage embryos does not adversely impact embryo survivability and subsequent developmental potential,” Hum. Reprod., vol. 40, no. 2, pp. 261–269, Feb. 2025, doi: 10.1093/humrep/deae283.

[11]     J. Lammers, A. Reignier, S. Loubersac, M. Chaillot, and T. Freour, “Ultra-Fast Warming Procedure of Vitrified Blastocysts Results in Maintained Embryology and Clinical Outcomes,” Reproductive Sciences 2024 32:2, vol. 32, no. 2, pp. 495–501, Jan. 2025, doi: 10.1007/s43032-024-01762-x.

[12]    L. Parmegiani et al., “Universal post-warming dilution of vitrified embryos: impact of different vitrification/warming kits, warming volume and rapid dilution/rehydration steps on survival and clinical outcomes,” Reprod. Biomed. Online, vol. 51, no. 3, p. 104923, Sep. 2025, doi: 10.1016/j.rbmo.2025.104923.

[13]    L. Parmegiani, C. Lynch, A. Arnone, and W. Ciampaglia, “P-128 Universal warming remains efficient with single-step elution warming protocols,” Human Reproduction, vol. 40, no. Supplement_1, Jun. 2025, doi: 10.1093/humrep/deaf097.437.

[14]    R. Kato et al., “One-step warming technique for vitrified human blastocysts using commercially available thawing solutions,” Reprod. Biomed. Online, vol. 52, no. 1, p. 105168, Jan. 2026, doi: 10.1016/j.rbmo.2025.105168.

[15]    T. M. T. Luu et al., “P-212 A comparison of multi-step versus single-step thawing protocols for vitrified blastocysts using thawing solution or culture media,” Human Reproduction, vol. 40, no. Supplement_1, Jun. 2025, doi: 10.1093/humrep/deaf097.521.