Nội dung chính

Hiện nay, vô sinh nam chiếm khoảng 40–50% các trường hợp vô sinh trên toàn thế giới.1,2 Trong số đó, khoảng 10-15% nam giới vô sinh mắc chứng không có tinh trùng (azoospermia), đặc biệt phổ biến nhất là không có tinh trùng không do tắc (Non obstructive azoospermia-NOA) - chiếm khoảng hai phần ba các trường hợp azoospermia.3 Ở nhóm bệnh nhân này, thực hiện thủ thuật thu nhận tinh trùng từ tinh hoàn là giải pháp thiết yếu nhằm tạo cơ hội có con bằng chính giao tử của người bệnh. Tuy nhiên, tinh trùng thu được từ các thủ thuật thường có số lượng rất ít, độ di động kém và chất lượng không đồng nhất. Trong bối cảnh đó, bảo quản lạnh tinh trùng giữ vai trò đặc biệt quan trọng, không chỉ giúp tối ưu hóa chiến lược điều trị hỗ trợ sinh sản mà còn hạn chế việc bệnh nhân phải trải qua nhiều lần can thiệp ngoại khoa khi chu kỳ IVF/ICSI không thành công.

Dù vậy, các phương pháp trữ lạnh tinh trùng truyền thống như sử dụng cọng rạ hoặc ống cryotube với thể tích tương đối lớn nhìn chung không phù hợp với những mẫu chỉ chứa số lượng tinh trùng rất hạn chế. Quá trình xử lý mẫu sau rã đông, bao gồm các bước pha loãng, ly tâm và rửa, có thể làm gia tăng nguy cơ tổn thương tế bào cũng như thất thoát tinh trùng do bám dính vào thành dụng cụ, từ đó làm giảm đáng kể tỷ lệ thu hồi sau rã đông.4

Nhằm khắc phục những hạn chế này, nhiều thiết bị chuyên biệt cho trữ lạnh tinh trùng số lượng ít đã được phát triển, bao gồm các hệ thống kín hoặc hở, các phương pháp đông lạnh thể tích nhỏ và các chiến lược thủy tinh hóa. Trên cơ sở đó, bài tổng quan này nhằm trình bày sự phát triển của các dụng cụ trữ lạnh tinh trùng số lượng ít, phân tích ưu điểm và hạn chế của từng kỹ thuật trong ứng dụng trữ lạnh tinh trùng số lượng ít.

    1. Dụng cụ sinh học (Biological carriers)

  • Empty Zona Pellucida

Màng ZP rỗng (empty zona pellucida, EZP) là một trong những phương pháp tiên phong trong trữ tinh trùng số lượng ít, được Cohen và cộng sự giới thiệu lần đầu vào năm 1997.5 Để tạo ra màng rỗng, các chuyên viên phôi học sẽ sử dụng noãn người (thường là noãn non, noãn chưa thụ tinh hoặc phôi không sử dụng) hoặc noãn động vật (như chuột, hamster). Tế bào chất và vật chất di truyền bên trong noãn/phôi sẽ được loại bỏ hoàn toàn thông qua các phương pháp hóa học hoặc cơ học. Sau khi làm rỗng ZP, tinh trùng sẽ được tiêm vào bên trong bằng kim ICSI (thường từ 1 đến 15 tinh trùng), rồi bảo quản trong môi trường có chất bảo vệ lạnh và trữ trong cọng rạ.5

Phương pháp này nhanh chóng thu hút sự quan tâm do khả năng hạn chế thất thoát tinh trùng trong quá trình xử lý, đồng thời hỗ trợ định vị và thu hồi tinh trùng thuận lợi hơn sau rã đông. Về mặt lâm sàng, EZP cũng là một trong những kỹ thuật đầu tiên chứng minh tính khả thi của việc trữ đông tinh trùng đơn lẻ, với các trường hợp trẻ sinh sống đã được báo cáo vào năm 1998.6 Tuy nhiên, việc ứng dụng EZP trong thực hành thường quy còn rất hạn chế do nhiều rào cản, bao gồm vấn đề đạo đức và pháp lý, sự khan hiếm nguồn noãn, thao tác vi kỹ thuật phức tạp, cũng như nguy cơ nhiễm chéo và tồn lưu vật liệu di truyền.7 Vì vậy, phương pháp này dần được thay thế bởi các dụng cụ nhân tạo an toàn và thực tiễn hơn.

  • Tảo cầu (Volvox globator spheres)

 

 

Hình 1: Dụng cụ sinh học. A – Màng ZP rỗng; B - Tảo cầu 1


Là một phương pháp lưu trữ sinh học mang tính độc đáo, được đề xuất bởi nhóm nghiên cứu của Just và cộng sự vào năm 2003-2004.8 Phương pháp này sử dụng các quả cầu tảo được hình thành từ tập đoàn tảo Volvox globator với mục đích làm “vật chứa” để bảo vệ những tinh trùng số lượng ít. Tảo Volvox có ưu điểm nổi bật là giá thành rẻ, dễ nuôi cấy và có sẵn nhiều trong tự nhiên. Việc sử dụng tảo cầu từng được xem là một giải pháp thay thế hiệu quả và tiết kiệm chi phí cho EZP. Phương pháp này cho thấy tiềm năng rất lớn với tỷ lệ thu hồi tinh trùng đạt mức tuyệt đối 100% và tỷ lệ duy trì độ di động sau rã đông khá tốt, đạt từ 50% đến 60%. Tuy nhiên phương pháp sử dụng tảo cầu vấp phải nhiều giới hạn nghiêm trọng. Hạn chế lớn nhất là rủi ro lây nhiễm các yếu tố di truyền hoặc sinh hóa chưa rõ từ tảo sang tế bào người. Bên cạnh đó việc chuẩn bị và duy trì các quần thể tảo đảm bảo hoàn toàn vô trùng (không bị nhiễm khuẩn) là một quá trình vô cùng phức tạp, tốn kém thời gian và công sức, hiện nay, vẫn chưa được các nhóm nghiên cứu khác thực hiện lặp lại thành công. Bên cạnh đó, theo các quy định khắt khe từ Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cũng như Chỉ thị về Mô của Châu Âu (the European Tissue Directive),9 việc sử dụng vật liệu có nguồn gốc từ tảo (mô ngoại lai) làm giá đỡ để bảo quản tinh trùng người bị nghiêm cấm sử dụng trong lâm sàng.

 

    1.  Dụng cụ tổng hợp - Hệ thống hở (Open systems)

  • Phương pháp vi giọt (microdroplet):

Đây là một kỹ thuật trữ lạnh được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm của các dụng cụ sinh học trong việc bảo quản tinh trùng số lượng ít. Nguyên lý của phương pháp này là tạo ra các vi giọt có thể tích nhỏ, từ vài µL đến 100 µL, chứa hỗn hợp tinh trùng và chất bảo vệ đông lạnh, các vi giọt sẽ được tạo trực tiếp trên đĩa cấy polystyrene, thường được phủ lên một lớp dầu paraffin để bảo vệ, sau đó tiến hành làm đông bằng đá khô hoặc hơi nitơ lỏng. Kỹ thuật này mang lại nhiều ưu điểm nổi bật như thao tác thực hiện nhanh chóng, đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị quá phức tạp và cho tỷ lệ thu hồi tinh trùng cao, thường đạt từ 90% đến 100%. Ngoài ra, một số báo cáo cũng ghi nhận đã có trường hợp có thai thành công khi sử dụng tinh trùng được bảo quản bằng phương pháp này.

Tuy nhiên, do là hệ thống hở, phương pháp này vẫn tiềm ẩn nguy cơ nhiễm chéo khi tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng. Ngoài ra, đĩa cấy polystyrene dễ giòn vỡ ở nhiệt độ cực thấp, cồng kềnh trong lưu trữ và thao tác. Ngoài ra, độ di động của tinh trùng sau rã đông thường biến  động và bị sụt giảm mạnh (có thể sụt giảm còn khoảng 50%), kèm theo đó là lớp dầu phủ lớn trên đĩa đòi hỏi thời gian làm ấm kéo dài hơn bình thường, có khả năng làm gián đoạn quy trình thực hiện.

  • Kim ICSI (ICSI pipettes)

Kim ICSI từng được đề xuất như một dụng cụ trực tiếp để trữ lạnh các trường hợp tinh trùng số lượng ít. Ở phương pháp này, tinh trùng sau chọn lọc được hút vào kim ICSI, tiếp xúc với chất bảo vệ làm lạnh rồi được đông lạnh bằng hơi hoặc nitơ lỏng. Ưu điểm nổi bật là khả năng kiểm soát chính xác vị trí tinh trùng, thuận lợi cho quan sát, hạn chế thất thoát mẫu và cho tỷ lệ thu hồi cao, có thể đạt khoảng 92%.10

Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của phương pháp này là kim ICSI bằng thủy tinh vô cùng mỏng manh, và rất dễ nứt gãy trong quá trình thao tác hoặc khi chịu biến đổi nhiệt độ đột ngột, dẫn đến nguy cơ mất toàn bộ mẫu. Ngoài ra, kỹ thuật này đòi hỏi hệ thống vi thao tác chuyên dụng, kỹ năng thực hiện cao, khó lưu trữ hiệu quả do kích thước nhỏ. Bên cạnh đó, đây là hệ thống hở nên vẫn tiềm ẩn nguy cơ nhiễm chéo từ môi trường nitơ lỏng trong quá trình bảo quản.

  • Vi nang gel (Alginate/Agarose beads)

Nhóm vi nang gel là một hướng tiếp cận khác trong trữ lạnh tinh trùng số lượng ít, được phát triển nhằm tạo ra một lớp vỏ bao bọc và giữ tinh trùng bên trong trong suốt quá trình trữ lạnh và rã đông, tương tự như cơ chế của ZP rỗng. Hai vật liệu được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm này là alginate và agarose.:

  • Vi nang Alginate: Được giới thiệu bởi Herrler và cộng sự vào năm 2006,11 phương pháp này sử dụng acid alginic (một loại polysaccarid từ rong biển) kết hợp với dung dịch canxi clorua để tạo thành các hạt gel chứa tinh trùng. Phương pháp này có ưu điểm là bảo vệ được cấu trúc tinh trùng tuy nhiên quy trình tạo vi nang phức tạp, tốn nhiều thời gian và hiệu suất không cao. Nhược điểm lớn nhất là phần acid alginic dư thừa trên bề mặt tinh trùng có thể làm giảm đáng kể độ di động sau rã đông (giảm khoảng 20% so với phương pháp thông thường). Ngoài ra, việc phải thực hiện các bước rửa ly tâm lặp đi lặp lại để loại bỏ lớp alginic acid này cũng làm tăng nguy cơ làm thất thoát tinh trùng.

  • Vi nang Agarose: Để khắc phục một số nhược điểm của alginate, các vi nang agarose, được phát triển với khả năng thao tác thuận lợi nhờ hình dạng quả cầu lõi rỗng (hollow-core).2 Cấu trúc mạng lưới của agarose giúp điều chỉnh thể tích dung dịch tốt hơn và thao tác dễ dàng hơn. Phương pháp này cho thấy kết quả rất hứa hẹn với tỷ lệ thu hồi tinh trùng sau rã đông cực cao (đạt từ 91,5% đến 100%) cũng như bảo tồn độ di động khá tốt (đạt từ 78% đến khoảng 85%).

Mặc dù mang lại tỷ lệ thu hồi cao, nhưng cả hai loại vi nang này hiện nay vẫn không được áp dụng rộng rãi. Nguyên nhân chủ yếu là do quy trình chuẩn bị nang vẫn còn phức tạp, tính ổn định của agarose trong quá trình nạp tinh trùng chưa được giải thích đầy đủ, và đặc biệt là phương pháp này vẫn còn thiếu các dữ liệu về tỷ lệ mang thai thành công trên lâm sàng

  • Cryoloop, Cryotop, Cryoleaf:

Là các vật chứa tổng hợp được phát triển để bảo quản tinh trùng số lượng ít bằng kỹ thuật vi thể tích. Ban đầu được sử dụng chủ yếu cho noãn và phôi, các thiết bị này sau đó được điều chỉnh để ứng dụng trong trữ lạnh tinh trùng số lượng ít nhờ khả năng làm lạnh cực nhanh và giảm thất thoát mẫu.

Cryoloop sử dụng một vòng nylon nhỏ để giữ vi giọt chứa tinh trùng, cho phép bảo quản số lượng rất ít tinh trùng với tỷ lệ thu hồi và độ di động sau rã đông ở mức tương đối tốt.12 Cryotop, với thiết kế dạng thanh nhựa mỏng, cho thấy hiệu quả thu hồi rất cao và thao tác đơn giản hơn, nên được xem là một trong những công cụ triển vọng nhất cho trữ lạnh tinh trùng cực ít.13 Trong khi đó, Cryoleaf là một thiết bị tự tạo có thể sử dụng với thể tích giọt rất nhỏ, giúp hạn chế các bước xử lý sau rã đông và đạt kết quả thu hồi khả quan trong một số báo cáo ban đầu.14

Tuy nhiên, điểm hạn chế chung của các hệ này là đa số hoạt động theo cơ chế hở, khiến mẫu tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng và làm dấy lên lo ngại về an toàn sinh học cũng như nguy cơ nhiễm chéo. Vì vậy, dù mang lại nhiều ưu thế về hiệu quả kỹ thuật, các giá đỡ này chủ yếu đóng vai trò nền tảng cho sự phát triển của các hệ kín an toàn hơn trong thực hành lâm sàng.

    1.  Dụng cụ tổng hợp - Hệ thống kín (Closed systems - Cải tiến mới nhất)

Trong thập kỷ qua, sự ra đời của các vật chứa tổng hợp dạng vi giọt (như Cryoloop, Cryotop) đã cải thiện đáng kể tỷ lệ thu hồi tinh trùng. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của chúng là thiết kế "hệ thống hở" trong đó tinh trùng tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng, làm tăng nguy cơ lây nhiễm chéo các loại vi khuẩn, nấm hoặc virus. Để khắc phục triệt để rủi ro an toàn sinh học này, các "hệ thống kín" (closed systems) đã được phát triển và được xem là cải tiến tiên tiến nhất hiện nay trong trữ lạnh tinh trùng số lượng ít:

  • Cell Sleeper

Cell Sleeper là một trong những hệ thống kín thương mại đầu tiên được sử dụng rộng rãi. Thiết bị này bao gồm một khay chứa đặt bên trong một ống vial được vặn nắp kín, giúp cách ly hoàn toàn mẫu vật với môi trường nitơ lỏng. Phương pháp này cho tỷ lệ thu hồi tinh trùng gần như tuyệt đối (lên tới 100%) và đã có những báo cáo về các ca sinh sống khỏe mạnh. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của Cell Sleeper là khay chứa bên trong có thiết kế gờ khá cao và cứng. Trong quá trình thực hiện vi tiêm ICSI, chuyên viên phôi học phải liên tục điều chỉnh nâng lên và hạ xuống kim vi tiêm, điều này làm tăng đáng kể nguy cơ làm gãy vỡ chiếc kim thủy tinh vốn rất mỏng manh.15

  • Cryopiece và Sperm VD (Sperm Vitrification Device)

Nhằm khắc phục những bất tiện trong thao tác của Cell Sleeper, các thiết bị thế hệ mới như Cryopiece và Sperm VD đã được phát triển.16 Điểm cải tiến quan trọng của các hệ này là thay thế cấu trúc khay có gờ cao bằng một bề mặt phẳng hoặc gần như phẳng, được đặt trong ống cryotube kín. Thiết kế này giúp kim ICSI có thể tiếp cận tinh trùng dễ dàng hơn trong giọt môi trường, từ đó làm đơn giản hóa quá trình tìm kiếm và thu hồi tinh trùng sau rã đông.

Nhờ ưu thế về mặt hình học và thao tác, Cryopiece và Sperm VD cho thấy hiệu quả kỹ thuật khả quan trong bảo quản tinh trùng số lượng ít. Sperm VD, với thể tích vi giọt khoảng 0,8–1 µL, được báo cáo có tỷ lệ thu hồi rất cao, đồng thời vẫn duy trì được độ di động sau rã đông ở mức chấp nhận được. Tương tự, Cryopiece cũng đạt tỷ lệ thu hồi cao, thao tác nhanh và đã được ứng dụng thành công trong lâm sàng, bao gồm cả các trường hợp vô sinh nam nặng như NOA và thiểu tinh nặng. Vì vậy, các thiết bị này được xem là bước cải tiến thực tiễn hơn so với các hệ trước đó, đặc biệt ở khía cạnh thao tác thuận tiện, an toàn mẫu và khả năng ứng dụng thường quy trong labo hỗ trợ sinh sản.

  • Thiết bị Cryotop trong ống (Cryotop vial device)

Thiết bị này là sự kết hợp giữa ưu điểm hạ nhiệt siêu tốc của Cryotop và tính an toàn của hệ thống kín. Cụ thể, thanh Cryotop sau khi nạp mẫu sẽ được đặt vào bên trong một ống cryo-vial và vặn nắp kín thay vì cắm vào một cọng rạ nhựa cứng như trước đây. Việc sở hữu vách bảo vệ kép với khoảng không khí ở giữa giúp giảm tốc độ truyền nhiệt đột ngột, hạn chế sự hình thành tinh thể đá nội bào. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy hệ thống này có khả năng bảo tồn tốt hơn độ di động, sức sống và tính toàn vẹn DNA của tinh trùng so với các thiết bị hở truyền thống. Vì vậy, đây được xem là một bước cải tiến có ý nghĩa, góp phần đưa các kỹ thuật trữ lạnh vi thể tích tiến gần hơn đến khả năng ứng dụng thường quy trong lâm sàng.17

 

 

Trữ lạnh tinh trùng số lượng ít là một chiến lược quan trọng trong hỗ trợ sinh sản, đặc biệt ở các trường hợp vô sinh nam nặng như NOA hoặc thiểu tinh rất nặng. Sự phát triển của các dụng cụ vi thể tích đã giúp cải thiện khả năng bảo quản, hạn chế thất thoát mẫu và mở rộng cơ hội sử dụng tinh trùng hiếm trong IVF/ICSI. Từ các giá mang sinh học đến các thiết bị tổng hợp thế hệ mới, xu hướng hiện nay là hướng tới các hệ kín có tính an toàn sinh học cao và thao tác thuận tiện hơn. Tuy nhiên, chưa có phương pháp nào tối ưu tuyệt đối cho mọi loại mẫu, vì vậy cần tiếp tục chuẩn hóa quy trình và tích lũy thêm bằng chứng lâm sàng để lựa chọn được chiến lược bảo quản phù hợp nhất trong thực hành thường quy.

1.         Liu S, Li F. Cryopreservation of single-sperm: where are we today? Reproductive Biology and Endocrinology. 2020;18(1):41.

2.         Jackson RE, Bormann CL, Hassun PA, et al. Effects of semen storage and separation techniques on sperm DNA fragmentation. Fertility and sterility. 2010;94(7):2626–2630.

3.         Esteves SC, Miyaoka R, Agarwal A. An update on the clinical assessment of the infertile male. Clinics. 2011;66(4):691–700.

4.         Liu S, Xu J, Liu B, Xian Y, Jiang M, Li F. Cryopreservation of single-sperm from semen and testicular samples: a 5-year monocentric experience in hundreds of patients. Reproductive biology and endocrinology: RB&E. 2026;

5.         Cohen J, Garrisi GJ, Congedo-Ferrara TA, Kieck KA, Schimmel TW, Scott RT. Cryopreservation of single human spermatozoa. Human Reproduction. 1997;12(5):994–1001.

6.         Walmsley R, Cohen J, Ferrara-Congedo T, Reing A, Garrisi J. The first births and ongoing pregnancies associated with sperm cryopreservation within evacuated egg zonae. Human Reproduction. 1998;13(suppl_4):61–70.

7.         Mangoli V, Evgeni E, Wyns C. Sperm cryopreservation protocol for micro-TESE-retrieved sperm. Asian journal of andrology. 2025;27(3):392–398.

8.         Just A, Gruber I, Wöber M, Lahodny J, Obruca A, Strohmer H. Novel method for the cryopreservation of testicular sperm and ejaculated spermatozoa from patients with severe oligospermia: a pilot study. Fertility and sterility. 2004;82(2):445–447.

9.         Lorian K, Agha-Rahimi A, Maleki B. Various aspects of cryopreservation of small numbers of sperm in assisted reproductive technology. Clinical and Experimental Reproductive Medicine. 2025;52(3):202.

10.       Gvakharia M, Adamson G. A method of successful cryopreservation of small numbers of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 2001;76(3):S101.

11.       Herrler A, Eisner S, Bach V, Weissenborn U, Beier HM. Cryopreservation of spermatozoa in alginic acid capsules. Fertility and Sterility. 2006;85(1):208–213.

12.       Desai NN, Blackmon H, Goldfarb J. Single sperm cryopreservation on cryoloops: an alternative to hamster zona for freezing individual spermatozoa. Reproductive BioMedicine Online. 2004;9(1):47–53.

13.       AbdelHafez F, Bedaiwy M, El-Nashar SA, Sabanegh E, Desai N. Techniques for cryopreservation of individual or small numbers of human spermatozoa: a systematic review. Human reproduction update. 2009;15(2):153–164.

14.       Peng Q-P, Cao S-F, Lyu Q-F, et al. A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 2011;47(8):565–572.

15.       Endo Y, Fujii Y, Shintani K, Seo M, Motoyama H, Funahashi H. Simple vitrification for small numbers of human spermatozoa. Reproductive biomedicine online. 2012;24(3):301–307.

16.       Huang C, Gan RX, Hu JL, et al. Clinical benefit for cryopreservation of single human spermatozoa for ICSI: a systematic review and meta‐analysis. Andrology. 2022;10(1):82–91.

17.       Bagheripour N, Khalili MA, Nabi A, Mahaldashtian M, Vahidi S, Agha-Rahimi A. A new cryotop vial device system provides an aseptic cryoprotectant-free and centrifuge-free cryopreservation of human spermatozoa (a closed system). Cryobiology. 2023;111:70–75.