Đánh giá khả năng sinh sản của nam giới trong thực hành lâm sàng chủ yếu dựa trên các thông số tinh dịch đồ như mật độ, độ di động và hình thái tinh trùng. Tuy nhiên, những thông số này không cung cấp trực tiếp thông tin về tính toàn vẹn của vật chất di truyền. Một số trường hợp vô sinh không rõ nguyên nhân hoặc thất bại hỗ trợ sinh sản vẫn có kết quả tinh dịch đồ trong giới hạn bình thường, cho thấy đánh giá tinh dịch đồ chưa phản ánh đầy đủ mọi khía cạnh liên quan đến chức năng sinh sản của tinh trùng^[1].

Phân mảnh DNA tinh trùng (Sperm DNA Fragmentation – SDF) mô tả sự hiện diện của tổn thương trên DNA tinh trùng và được nghiên cứu như một nguồn thông tin bổ sung trong đánh giá vô sinh nam. Nhiều kỹ thuật đã được phát triển để đánh giá SDF, phổ biến gồm Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA), Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling (TUNEL), Sperm Chromatin Dispersion (SCD) và Comet assay^[1]. Trong đó, SCSA là một trong những kỹ thuật được nghiên cứu từ lâu và có quy trình tương đối chuẩn hóa. Phương pháp này dựa trên khả năng DNA tinh trùng bị biến tính trong môi trường acid, kết hợp nhuộm Acridine Orange (AO) và phân tích bằng dòng chảy tế bào. SCSA cho phép đánh giá hàng nghìn tinh trùng trong mỗi mẫu và cung cấp hai thông số chính là DNA Fragmentation Index (DFI) và High DNA Stainability (HDS)^[2]. Bài viết này tập trung trình bày nguyên lý của SCSA, ý nghĩa của DFI và HDS, độ lặp lại của phép đo và cách diễn giải kết quả trong thực hành.

2.1. Từ cấu trúc chromatin tinh trùng đến khả năng biến tính DNA

Trong quá trình biệt hóa tinh trùng, phần lớn histone được thay thế bằng protamine, giúp DNA được nén chặt trong nhân. Cấu trúc chromatin cô đặc góp phần bảo vệ vật chất di truyền trong quá trình tinh trùng trưởng thành và di chuyển qua đường sinh dục. Những bất thường trong quá trình tái cấu trúc chromatin hoặc tổn thương DNA có thể làm tăng tính nhạy cảm của DNA với các tác nhân gây biến tính^[1,3].

SCSA được thực hiện bằng cách cho mẫu tinh trùng tiếp xúc với dung dịch acid ở pH=1,20 trong 30 giây. Những vùng DNA có cấu trúc kém ổn định hoặc có tổn thương dễ chuyển từ trạng thái sợi đôi sang sợi đơn hơn so với DNA được bảo vệ trong chromatin bình thường^[2]. Do đó, SCSA chủ yếu đánh giá mức độ nhạy cảm của chromatin tinh trùng đối với biến tính acid, thay vì trực tiếp đánh dấu từng vị trí đứt gãy DNA như TUNEL.

2.2. Acridine Orange và tín hiệu huỳnh quang

Sau bước biến tính, mẫu được nhuộm bằng AO. Khi tương tác với DNA sợi đôi, AO phát huỳnh quang chủ yếu ở vùng xanh lá. Khi gắn với DNA đã chuyển thành sợi đơn, tín hiệu chuyển sang vùng đỏ. Hai tín hiệu được ghi nhận bằng dòng chảy tế bào dưới kích thích laser 488 nm^[2].

Với mỗi tinh trùng, mức độ biến tính DNA có thể được biểu thị bằng hệ số: αt = Red / (Red + Green). Trong quy trình SCSA, khoảng 5.000-10.000 tinh trùng có thể được phân tích trong một mẫu. Dữ liệu huỳnh quang của từng tế bào được biểu diễn trên cytogram và sử dụng để xác định quần thể có mức biến tính DNA tăng cao^[2].

Khả năng phân tích hàng nghìn tinh trùng trong mỗi mẫu giúp kết quả phản ánh tốt hơn đặc điểm của quần thể tinh trùng. Tuy nhiên, độ tin cậy của phép đo vẫn phụ thuộc vào quy trình xử lý mẫu, hiệu chuẩn thiết bị và phương pháp phân tích dữ liệu.

3.1. DNA Fragmentation Index (DFI)

DFI là thông số chính của SCSA, biểu thị tỷ lệ tinh trùng có DNA/chromatin nhạy cảm với biến tính acid ở mức cao. DFI tăng cho thấy tỷ lệ tinh trùng có bất thường liên quan đến tính toàn vẹn DNA/chromatin trong mẫu cao hơn. Do nguyên lý đo khác nhau giữa các xét nghiệm SDF, giá trị DFI của SCSA cần được diễn giải trong phạm vi của chính phương pháp này^[3].

3.2. High DNA Stainability

Bên cạnh DFI, SCSA còn cung cấp thông số High DNA Stainability (HDS), phản ánh quần thể tinh trùng có mức bắt màu DNA cao. HDS thường liên quan với tình trạng chromatin chưa trưởng thành hoàn toàn, trong đó quá trình thay thế histone bằng protamine chưa diễn ra đầy đủ^[2]. Vì vậy, thông số này cung cấp thêm thông tin về mức độ trưởng thành của chromatin tinh trùng.

So với DFI, bằng chứng về giá trị lâm sàng của HDS hiện còn hạn chế hơn. Trong nghiên cứu của Jerre và cộng sự (2019) trên 1.602 thai kỳ sau IVF hoặc ICSI, HDS cao có liên quan với nguy cơ sẩy thai sớm tăng nhẹ. Mối liên hệ này rõ hơn ở nhóm ICSI, trong khi không được ghi nhận tương tự ở nhóm IVF^[4].

Những dữ liệu hiện có cho thấy HDS có thể bổ sung thông tin về mức độ trưởng thành chromatin của quần thể tinh trùng, nhưng giá trị của thông số này trong dự báo kết quả sinh sản vẫn chưa được xác định rõ.

Khả năng phân tích số lượng lớn tinh trùng bằng dòng chảy tế bào cùng quy trình được kiểm soát chặt là một trong những ưu điểm kỹ thuật của SCSA. Trong nghiên cứu của Vidya Laxme và cộng sự (2020), hệ số biến thiên trung bình của các phép đo lặp lại bằng SCSA là 4,7%, thấp hơn đáng kể so với hai bộ xét nghiệm SCD được đánh giá, lần lượt là 24,2% và 27,2%^[5]. Kết quả này cho thấy SCSA có độ lặp lại kỹ thuật tốt khi điều kiện xét nghiệm được chuẩn hóa. Tuy nhiên, độ lặp lại kỹ thuật tốt không đồng nghĩa với việc DFI ổn định giữa các lần lấy mẫu.

Biến thiên giữa các lần lấy mẫu có thể liên quan đến nhiều yếu tố sinh học như tuổi, hút thuốc, giãn tĩnh mạch thừng tinh, tình trạng viêm nhiễm và lối sống. Thời gian kiêng xuất tinh cũng có thể ảnh hưởng đến SDF, một số dữ liệu cho thấy thời gian kiêng kéo dài liên quan đến SDF cao hơn, trong khi rút ngắn thời gian kiêng có thể làm giảm SDF ở một số nam giới^[1].

Ngoài biến thiên sinh học, độ tin cậy của SCSA còn phụ thuộc vào mức độ tuân thủ quy trình xét nghiệm. Thời gian xử lý acid, nồng độ AO, hiệu chuẩn thiết bị, mẫu đối chứng và cách xác định vùng phân tích (gating) đều có thể ảnh hưởng đến kết quả. Vì vậy, độ lặp lại kỹ thuật của SCSA gắn liền với mức độ chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng của phòng xét nghiệm.

5. So sánh SCSA với TUNEL, SCD và Comet

SCSA, TUNEL, SCD và Comet đều được sử dụng trong đánh giá SDF nhưng dựa trên các nguyên lý đo khác nhau.

TUNEL đánh dấu trực tiếp các đầu DNA tự do, trong khi Comet assay đánh giá mức độ di chuyển của DNA trong điện trường. SCD dựa trên hình thái phân tán chromatin sau xử lý, SCSA lại đánh giá mức độ nhạy cảm của chromatin với biến tính acid thông qua sự thay đổi tín hiệu AO^[3].

Sự khác biệt giữa các phương pháp được thể hiện trong nghiên cứu của Calamai và cộng sự (2025), khi SCSA, TUNEL, SCD và Comet được áp dụng đồng thời trên cùng mẫu tinh trùng trước và sau đông lạnh hoặc sau một khoảng thời gian ủ mẫu trong điều kiện phòng thí nghiệm. Cả bốn kỹ thuật đều ghi nhận sự gia tăng SDF, nhưng mức độ thay đổi không hoàn toàn tương đồng giữa các phương pháp. Đặc biệt, sau đông lạnh, TUNEL ghi nhận mức tăng tổn thương DNA rõ hơn so với một số kỹ thuật còn lại^[6].

Kết quả này cho thấy các xét nghiệm SDF phản ánh những đặc điểm khác nhau của tổn thương DNA tinh trùng và không thể sử dụng thay thế trực tiếp cho nhau. Vì vậy, ngưỡng tham chiếu và ý nghĩa của kết quả cần được diễn giải theo từng phương pháp xét nghiệm, thay vì áp dụng chung giữa các kỹ thuật.

Các nghiên cứu ban đầu về SCSA ghi nhận DFI khoảng 25% có liên quan đến khả năng có thai tự nhiên hoặc sau bơm tinh trùng vào buồng tử cung (Intrauterine Insemination - IUI) thấp hơn. Evenson (2022) vẫn sử dụng ngưỡng này như một mốc tham khảo khi diễn giải kết quả SCSA^[2]. Tuy nhiên, DFI không phản ánh trực tiếp khả năng sinh sản của từng cá thể. Các tổng quan cho thấy ngưỡng khoảng 20-30% có thể liên quan với kết quả sinh sản kém hơn, nhưng giá trị dự báo còn hạn chế và thay đổi tùy theo phương pháp xét nghiệm^[1].

Trong hỗ trợ sinh sản, giá trị tiên lượng của SDF cũng chưa thật sự rõ ràng. Phân tích gộp của Cissen và cộng sự (2016) trên 30 nghiên cứu cho thấy các xét nghiệm SDF có khả năng dự đoán thai kỳ sau IVF/ICSI còn hạn chế; riêng SCSA và SCD cũng cho thấy giá trị tiên lượng thấp. Các tác giả vì vậy chưa ủng hộ việc sử dụng SDF thường quy để dự đoán khả năng có thai hoặc lựa chọn giữa IVF và ICSI^[7].

DFI được xác định trên toàn bộ quần thể tinh trùng trong mẫu, trong khi chỉ một số rất ít tinh trùng được lựa chọn để thụ tinh. Do đó, DFI của mẫu không phản ánh trực tiếp tình trạng DNA của tinh trùng được sử dụng cho ICSI. Kết quả SCSA nên được xem là thông tin bổ sung về tình trạng DNA của mẫu tinh trùng, hơn là một chỉ số dự đoán kết quả của từng noãn, phôi hoặc chu kỳ điều trị.

Các hướng dẫn hiện hành chủ yếu đưa ra khuyến nghị đối với xét nghiệm SDF nói chung, trong đó SCSA là một trong những phương pháp được sử dụng. Theo European Association of Urology (EAU), xét nghiệm SDF không được khuyến cáo thực hiện thường quy cho tất cả nam giới vô sinh, nhưng có thể được cân nhắc trong một số tình huống như sẩy thai liên tiếp, thất bại hỗ trợ sinh sản hoặc vô sinh không rõ nguyên nhân^[8].

Trong thực hành, DFI có thể thay đổi theo tình trạng sinh học và đặc điểm của mẫu tinh trùng. Ở nam giới có giãn tĩnh mạch thừng tinh, SDF thường được ghi nhận cao hơn và có thể thay đổi sau điều trị. Mức SDF cũng có thể khác nhau giữa tinh trùng xuất tinh và tinh trùng lấy từ tinh hoàn ở một số trường hợp^[8]. Vì vậy, nguồn mẫu và bối cảnh lấy mẫu cần được xem xét khi diễn giải kết quả SCSA.

Kết quả SCSA cũng cần được đặt cùng tinh dịch đồ, bệnh sử, các yếu tố nam khoa, thời gian kiêng xuất tinh và tiền sử điều trị. Sự thay đổi DFI giữa các lần xét nghiệm hoặc sau một can thiệp không đồng nghĩa với sự thay đổi tương ứng của kết quả sinh sản^[1].

Một trong những giới hạn của SCSA xuất phát từ nguyên lý của phương pháp. SCSA không trực tiếp xác định các vị trí đứt gãy DNA mà đánh giá mức độ nhạy cảm của chromatin với quá trình biến tính trong môi trường acid. Vì vậy, DFI phản ánh tình trạng toàn vẹn DNA/chromatin của quần thể tinh trùng nhưng không cho biết cụ thể loại, vị trí hay mức độ tổn thương DNA ở cấp độ phân tử^[3].

Bên cạnh đó, độ tin cậy của SCSA phụ thuộc nhiều vào mức độ chuẩn hóa của quy trình xét nghiệm. Phương pháp này cần hệ thống phân tích dòng chảy tế bào, kiểm soát chặt các bước xử lý mẫu, điều kiện nhuộm và hiệu chuẩn thiết bị. Đây là cơ sở giúp SCSA có độ lặp lại tốt, nhưng đồng thời cũng làm tăng yêu cầu về trang thiết bị và kiểm soát chất lượng tại phòng xét nghiệm.

Một vấn đề khác là cách diễn giải ngưỡng DFI. Các ngưỡng được đề xuất hiện nay chủ yếu dựa trên mối liên quan giữa DFI và kết quả sinh sản ở các quần thể nghiên cứu. Do đó, những ngưỡng này nên được sử dụng như mốc tham khảo, thay vì xem là giới hạn xác định khả năng sinh sản của từng cá thể.

Giá trị lâm sàng của SDF cũng chưa hoàn toàn thống nhất giữa các nghiên cứu. Tổng quan của Esteves và cộng sự (2021) cho thấy mức độ bằng chứng cho nhiều khuyến nghị liên quan đến SDF còn ở mức trung bình đến thấp^[1]. Phân tích gộp của Cissen và cộng sự (2016) cũng cho thấy khả năng dự báo thai kỳ của các xét nghiệm SDF còn hạn chế, vì vậy kết quả xét nghiệm chưa phù hợp để sử dụng độc lập trong dự đoán kết quả điều trị^[7].

SCSA là phương pháp đánh giá gián tiếp tình trạng DNA tinh trùng thông qua mức độ nhạy cảm của chromatin với biến tính acid, kết hợp nhuộm Acridine Orange và phân tích dòng chảy tế bào. DFI phản ánh tỷ lệ tinh trùng có DNA/chromatin nhạy cảm với biến tính, trong khi HDS cung cấp thêm thông tin về mức độ trưởng thành của chromatin. Khả năng phân tích số lượng lớn tinh trùng cùng quy trình tương đối chuẩn hóa giúp SCSA có độ lặp lại kỹ thuật tốt. Tuy nhiên, kết quả xét nghiệm chịu ảnh hưởng của đặc điểm mẫu, điều kiện tiền phân tích và ngưỡng tham chiếu của từng phương pháp. Trong thực hành, SCSA cung cấp thêm thông tin về tình trạng DNA/chromatin của quần thể tinh trùng và cần được diễn giải cùng các dữ liệu liên quan, thay vì sử dụng độc lập để dự đoán kết quả sinh sản.

[1] Esteves SC, Zini A, Coward RM, Evenson DP, Gosálvez J, Lewis SEM, et al. Sperm DNA fragmentation testing: summary evidence and clinical practice recommendations. Andrologia. 2021;53(2):e13874. doi:10.1111/and.13874.

[2] Evenson DP. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA®) for fertility assessment. Curr Protoc. 2022;2(8):e508. doi:10.1002/cpz1.508.

[3] Conti D, Calamai C, Muratori M. Sperm DNA fragmentation in male infertility: tests, mechanisms, meaning and sperm population to be tested. J Clin Med. 2024;13(17):5309. doi:10.3390/jcm13175309.

[4] Jerre E, Bungum M, Evenson D, Giwercman A. Sperm chromatin structure assay high DNA stainability sperm as a marker of early miscarriage after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 2019;112(1):46-53.e2. doi:10.1016/j.fertnstert.2019.03.013.

[5] Vidya Laxme B, Stephen S, Devaraj R, Mithraprabhu S, Bertolla RP, Mahendran T. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 2020;47(4):277-283. doi:10.5653/cerm.2020.03860.

[6] Calamai C, Tanturli M, Conti D, Leter G, Vignozzi L, Giovannelli L, et al. Induction of sperm DNA fragmentation by cryopreservation and in vitro incubation: comparison of TUNEL, SCSA, SCD test and COMET assay. Int J Mol Sci. 2025;26(18):8978. doi:10.3390/ijms26188978.

[7] Cissen M, van Wely M, Scholten I, Mansell S, de Bruin JP, Mol BW, et al. Measuring sperm DNA fragmentation and clinical outcomes of medically assisted reproduction: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 2016;11(11):e0165125. doi:10.1371/journal.pone.0165125.

[8] European Association of Urology. EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health. Edn. presented at the EAU Annual Congress London 2026. Arnhem, the Netherlands: EAU Guidelines Office; 2026.