So sánh hiệu quả của việc đánh giá thụ tinh trên hệ thống giám sát phôi liên tục (Time-lapse monitoring) và phương pháp đánh giá hình thái tĩnh

Đánh giá thụ tinh dựa trên quan sát tiền nhân (pronuclei, PN) tại thời điểm 16 -17 giờ sau khi tinh trùng vào noãn (hours post-insemination, hpi) trong chu kỳ thụ tinh nhân tạo cổ điển (conventional in vitro fertilization, c-IVF) hoặc tiêm tinh trùng và bào tương noãn (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) theo khuyến cáo của Đồng thuận Istanbul 2025 (ESHRE/ALPHA), là một bước kiểm soát chất lượng quan trọng trong quá trình nuôi cấy phôi của chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm. Theo thực hành quan sát hình thái tĩnh, số lượng tiền nhân (pronuclear – PN) thường được ghi nhận tại một thời điểm cố định, chỉ ghi lại “ảnh chụp nhanh” của quá trình hình thành PN. Tuy nhiên, sự xuất hiện, hợp nhân và mờ dần của PN là một quá trình động học liên tục với cửa sổ hiển thị kéo dài từ khoảng 3 giờ đến hơn 31 giờ sau cấy thụ tinh (IVF) hoặc ICSI. Hệ thống giám sát phôi liên tục (time-lapse monitoring, TLM) cung cấp dữ liệu động học hình thái toàn diện, cho phép xác định tương đối chính xác thời điểm xuất hiện PN (time of pronuclear appearance, tPNa), hình dạng PN và thời điểm PN mờ dần (time of pronuclear fading, tPNf) từ đó phân biệt các nhóm PN bất thường thực sự, (bao gồm 0PN, 1PN, 3PN và nhiều PN) với các hợp tử bình thường bị phân loại sai do hạn chế của đánh giá tĩnh [1].

Xác nhận thụ tinh bình thường là quyết định quan trọng đầu tiên và có hệ quả lâm sàng đáng kể trong một chu kỳ nuôi cấy phôi trong hỗ trợ sinh sản (HTSS). Trong thực hành truyền thống, các hợp tử được xác định là “thụ tinh bất thường’’ thường bị loại khỏi chu kỳ điều trị, làm giảm số lượng phôi có khả năng được nuôi cấy tiếp, đông lạnh hoặc chuyển phôi cho bệnh nhân. Theo Đồng thuận Istanbul 2011, đánh giá thụ tinh bằng quan sát hình thái tĩnh được thực hiện vào khoảng 17±1 hpi, với hình ảnh thụ tinh bình thường gồm hai tiền nhân có kích thước tương đương (2PN), nằm gần nhau và có màng rõ, kèm theo thể cực thứ hai (second polar body, PB2) [2]. Tuy nhiên, sự hình thành, đối vị và phân rã tiền nhân (pronuclear breakdown, PNBD) là một quá trình động học có biến thiên sinh học đáng kể. Do đó, quan sát tại một thời điểm cố định có thể bỏ sót các hợp tử có PN xuất hiện hoặc mờ dần ngoài cửa sổ đánh giá, dẫn đến nguy cơ phân loại nhầm một số phôi có tiềm năng phát triển là 0PN hoặc thụ tinh bất thường. Sự vắng mặt, xuất hiện thừa, hoặc thiếu đối xứng của các PN được phân loại là thụ tinh bất thường, bao gồm: 0PN (không thấy tiền nhân), 1PN (một tiền nhân), 2.1PN (hai PN kích thước bình thường kèm một tiền nhân kích thước nhỏ hơn đáng kể, tần suất <1%), và 3PN (ba tiền nhân đầy đủ) hoặc nhiều hơn 3PN [1].

Sự ra đời của hệ thống TLM cho phép ghi nhận liên tục các sự kiện động học hình thái trong giai đoạn thụ tinh sớm, bao gồm thời điểm xuất hiện của PN thay vì một trạng thái cố định, từ đó hỗ trợ diễn giải chính xác hơn các kiểu hình PN không điển hình như không quan sát thấy PN, 1PN, 2.1PN và 3PN. Đồng thuận Istanbul cập nhật 2025 khuyến cáo đánh giá số lượng PN ở 16-17hpi trong cả cIVF và ICSI nhằm giảm nguy cơ phân loại nhầm hợp tử có PNBD sớm là noãn không thụ tinh; những trường hợp phát triển bình thường nhưng không quan sát được PN, thuật ngữ “không nhìn thấy PN” phù hợp hơn so với “0PN” hoặc “không thụ tinh’’. Ngược lại, một số nhóm PN bất thường có thể có biểu hiện hình thái tương đồng với 2PN tại một thời điểm nhất định nhưng lại thể hiện các bất thường hình thái động học quan trọng như bất đối xứng tPNa, khoảng cách tPNa-tPNf bất thường, hoặc sự phân rã PNBD không đồng bộ chỉ phát hiện được qua TLM [1]. Tuy nhiên, TLM không xác định được bộ nhiễm sắc thể hay nguồn gốc vật chất di truyền từ bố mẹ của phôi.

Vì vậy, câu hỏi được đặt ra là: Đánh giá thụ tinh qua quan sát hình thái tĩnh và TLM khác nhau như thế nào trong việc phân loại các nhóm PN và tác động như thế nào đến khả năng sử dụng phôi và kết quả lâm sàng?

Hạn chế của đánh giá qua quan sát hình thái tĩnh trong đánh giá thụ tinh

Bản chất động học của quá trình hình thành và mờ dần của tiền nhân

Tiền nhân là một cấu trúc động học, không xuất hiện và tồn tại cố định trong một khoảng thời gian dài. Dữ liệu từ các nghiên cứu TLM cho thấy toàn bộ quá trình từ xuất hiện đến mờ dần của PN diễn ra với biên độ dao động lớn giữa các hợp tử:

• Thời điểm xuất hiện PN (time of pronuclear appearance, tPNa) trung bình sau ICSI khoảng 5-8 hpi; tPNa trung bình sau IVF thông thường (cIVF): khoảng 6-10 hpi. Sự khác biệt này phản ánh việc ICSI bỏ qua giai đoạn tinh trùng xuyên qua màng zona. Trường hợp tPNa xuất hiện trễ hơn 12 hpi được phân loại là "tPNa muộn", là một dấu hiệu hình thái động học bất thường có liên quan đến tiên lượng phôi phát triển kém.
• Thời điểm PN mờ dần (time of pronuclear fading, tPNf) dao động rộng từ khoảng 17-33 hpi, trung bình khoảng 25,2 hpi trong nhóm cIVF. Trong TLM, tPNf được ghi nhận là thời điểm PN mờ dần khỏi hình ảnh (fading/disappearance), không nhất thiết trùng với thời điểm hợp nhân nhiễm sắc thể (syngamy) quan sát được [3].

Sai xác nhận PN trong đánh giá hình thái tĩnh

Kobayashi và cộng sự (2021) đã thực hiện nghiên cứu đánh giá trực tiếp sự khác biệt về tỷ lệ 0PN giữa TLM và đánh giá tĩnh trong cIVF cho thấy phần lớn hợp tử bị phân loại thành 0PN là phôi phân chia sớm (early-cleaved embryos) có PN mờ dần sớm hơn ngưỡng bình thường (khoảng 23-25 hpi). Khi TLM bắt đầu từ 6-9 hpi (thay vì chờ đến 18-21 hpi như quan sát hình thái tĩnh), các PN này được ghi nhận trước khi mờ dần, loại bỏ hoàn toàn sai phân loại. Quan trọng hơn, nhóm PB mờ dần sớm (tPNf <20 hpi) được xác nhận hình thành phôi nang chất lượng tốt và có kết quả thai lâm sàng tương đương các phôi bình thường [3].

Coticchio và cộng sự (2025) mở rộng phân tích trên đoàn hệ ICSI lớn hơn (4.479 hợp tử 2PN), làm sáng tỏ cả hai phía của phổ động học PN đều có thể gây sai phân loại trong cửa sổ 16-18 hpi [4]:

• PN mờ dần sớm: 11 hợp tử 2PN có tPNf <16 hpi (PN đã mờ dần trước khi cửa sổ quan sát bắt đầu)
• PN xuất hiện muộn: 85 hợp tử 2PN có tPNa >16 hpi (muộn nhất 31 hpi) (PN chưa xuất hiện tại thời điểm quan sát tiêu chuẩn)

Nghiên cứu này lần đầu tiên định nghĩa và mô tả đầy đủ nhóm 0PN thật (755 noãn không hình thành PN trong toàn bộ chu kỳ TLM): dù 186/755 trường hợp (24,6%) thực hiện ít nhất một lần phân chia, tất cả đều dừng phát triển trước giai đoạn nén của phôi, thường biểu hiện các dấu hiệu bất thường về hình thái động học, bao gồm phân chia trực tiếp (direct cleavage), phân chia ngược (reverse cleavage), phân chia hỗn loạn (chaotic cleavage), hình thành không bào (vacuolization), và phân mảnh lan rộng (extensive fragmentation).

Đây là nguồn gốc cơ bản nhất của sai phân loại trong đánh giá tĩnh: không phải do lỗi quan sát của chuyên viên phôi học, mà do bản chất động học nội tại của quá trình hình thành và mờ dần PN vốn không thể nắm bắt đầy đủ qua một lần quan sát hình thái tĩnh tại một thời điểm cố định.

Hợp tử bị phân loại 0PN do PN mờ dần sớm không phải thụ tinh thất bại thực sự. Những hợp tử này có tỷ lệ hình thành phôi nang và kết quả lâm sàng tương đương nhóm 2PN chuẩn. Coticchio (2025) phân biệt rõ hai nhóm có tiên lượng trái ngược: (1) nhóm "0PN do PN đã mờ dần trước cửa sổ quan sát có tiềm năng phát triển thành phôi nang tốt; (2) nhóm 0PN thật sự -không hình thành PN trong toàn bộ chu kỳ TLM- dù 24,6% trong số này có thể phân chia nhưng 100% dừng trước khi nén và không có trường hợp nào tạo phôi nang. Bên cạnh đó, tPNf là biến hình thái động học tiên lượng độc lập quan trọng: tỷ lệ hình thành phôi nang đạt cao nhất ở nhóm tPNf 18-20 hpi (65,4%), giảm dần ở nhóm tPNf >20 hpi (53,3%), 16-18 hpi (47,7%), và thấp nhất ở tPNf <16 hpi (36,4%). Đồng thời, nhóm tPNa muộn (>16 hpi) có tỷ lệ tạo phôi nang thấp hơn đáng kể so với nhóm tPNa bình thường (29,4% vs. 54,5%, p < 0.001), và nhóm tPNf 18-20 hpi cũng ghi nhận tỷ lệ phôi lưỡng bội cao hơn các nhóm còn lại [4]. Toàn bộ thông tin phân tầng nguy cơ này hoàn toàn không thu được bằng quan sát hình thái tĩnh.

Đánh giá 1PN bằng TLM và quan sát hình thái tĩnh

Tiền nhân đơn (1PN) là nhóm có phân loại phức tạp nhất trong thực hành IVF/ICSI. Quan sát hình thái tĩnh được thực hiện một lần tại thời điểm cố định có thể tạo ra sai lầm trong phân loại gồm:

• Hiện tượng hai PN hình thành không đồng bộ dẫn đến chỉ thấy một PN tại thời điểm kiểm tra
• Hiện tượng hợp nhân sớm: hai PN hình thành bình thường nhưng hợp nhất trước khi quan sát
• PN thứ 2 xuất hiện muộn sau cửa sổ quan sát hoặc xuất hiện trước và mờ dần trước khi quan sát, dẫn đến bỏ lỡ PN thứ 2.

Điều này dẫn đến việc toàn bộ nhóm 1PN bị xử trí đồng nhất, bỏ qua sự khác biệt sinh học căn bản giữa 1PN cIVF và 1PN ICSI, và theo quan niệm truyền thống, nhóm này thường bị loại bỏ thường quy do được giả định là đơn bội.

TLM giải quyết được giới hạn trên thông qua theo dõi liên tục 24/7 trong suốt quá trình nuôi cấy. Mateo và cộng sự (2017)  thiết lập tiêu chuẩn thực hành đầu tiên dùng TLM (EmbryoScope) để phân loại và lựa chọn 1PN ICSI: trong số 88 hợp tử 1PN 2PB ICSI được nuôi cấy trong tủ nuôi cấy time-lapse, hệ thống ghi nhận đầy đủ thời điểm xuất hiện của hai thể cực, thời điểm tPNa và tPNf của PN, đồng thời loại trừ 2PN xuất hiện không đồng bộ, PN hợp nhân trong toàn bộ chu kỳ, giúp xác nhận đây là 1PN  thật sự chứ không phải 2PN bị bỏ lỡ. Đây là thông tin phân loại mà quan sát hình thái tĩnh hoàn toàn không thu được. Sau khi TLM lọc và xác nhận 1PN 2PB từ 88 hợp tử ban đầu, phân tích bằng sàng lọc di truyền tiền làm tổ (preimplantation genetic screening, PGS) hiện nay gọi là PGT-A (preimplantation genetic testing for aneuploi, xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi nhằm phát hiện các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể (lệch bội) của phôi) cho thấy 17% (15/88) là lưỡng bội; tỷ lệ tạo phôi nang ngày 5 là 3,4% (3/88); phôi nang lưỡng bội đạt 2,3% (2/88); và 2 chu kỳ chuyển phôi trữ cho kết quả 1 trẻ sinh sống khỏe mạnh. Từ kết quả này, Mateo kết luận rằng phôi 1PN 2PB ICSI có thể được xem xét chuyển phôi khi không còn phôi 2PN 2PB nào, với điều kiện TLM đã xác nhận đủ tiêu chí và PGT-A xác nhận lưỡng bội [5].

Ngoài vai trò phân loại, TLM còn cung cấp thông tin hình thái động học giúp tiên lượng tiềm năng phát triển của phôi 1PN - điều mà đánh giá hình thái tĩnh không thể cung cấp. Mateo và cộng sự (2020) phân tích động học hình thái trên 149 hợp tử 1PN ICSI và 195 hợp tử 2PN ICSI (nhóm chứng) trong tủ cấy TLM, cho thấy phôi 1PN ICSI có tỷ lệ tạo phôi nang thấp hơn đáng kể (28,9% so với 67,2%) và khác biệt về nhiều tham số động học hình thái hơn so với nhóm 2PN [6].

Lee (2026) kết luận rằng phôi 1PN có thể sử dụng và mở rộng lựa chọn cho bệnh nhân có tiên lượng xấu và số phôi 2PN hạn chế, đồng thời khuyến nghị các nghiên cứu tương lai nên sử dụng TLM và PGT-A đồng thời để xác nhận tình trạng di truyền, và nhấn mạnh TLM là điều kiện tiên quyết, không phải tùy chọn, trong quy trình xử lý phôi 1PN [7].

TLM phát hiện các bất thường PN mà quan sát hình thái tĩnh không ghi nhận được

Ngoài phân loại nhóm PN, TLM giúp phát hiện nhiều biến thể hình thái động học của quá trình thụ tinh mà quan sát hình thái tĩnh không thể ghi nhận. Coticchio và cộng sự (2018)- phân tích hồi cứu TLM trên 500 noãn ICSI với 28 tham số động học hình thái cung cấp bản mô tả động học hình thái quá trình thụ tinh chi tiết đến từng thời điểm, xác định hàng loạt hiện tượng sinh học mà quan sát hình thái tĩnh một lần hoàn toàn không thu được [8], bao gồm:

• Sóng bào tương (cytoplasmic wave -CW): TLM ghi nhận CW luôn xuất hiện ngay trước khi PN hình thành, bắt nguồn từ vị trí PN đực và lan ra ngoại vi noãn, theo trình tự cố định: 2-3 giờ sau tống xuất thể cực thứ 2 (PB2 extrusion) và ngay trước tPNa. Đây là hiện tượng chưa được mô tả trước khi có TLM, vì hiện tượng này chỉ tồn tại trong một khoảng thời gian ngắn và đòi hỏi theo dõi liên tục. CW được đề xuất là dấu hiệu sinh học không xâm lấn tiềm năng về chất lượng phôi.
• Động học hình thành PN: Thời điểm xuất hiện thể cực thứ 2 được ghi nhận bằng TLM như mốc thời gian khởi đầu cho toàn bộ chuỗi sự kiện thụ tinh. PN đực và PN cái xuất hiện gần như đồng thời tại khoảng 6,2 hpi sau ICSI. TLM ghi nhận: PN cái luôn hình thành tại vị trí vỏ noãn (cortical), gần vị trí PB2 xuất hiện trong khi PN đực hình thành ở các vị trí khác nhau (53,6% ở trung tâm; 31,2% trung gian; 15,2% ở vỏ noãn.) Vị trí hình thành PN đực có khả năng dự đoán vị trí PN tiếp giáp và có liên quan đến chất lượng phôi ngày 3. Thời điểm xuất hiện thể cực thứ 2 là tiêu chí bắt buộc để lựa chọn hợp tử 1PN 2PB ICSI xem xét sinh thiết. Đây là thông tin hoàn toàn không thu được từ quan sát hình thái tĩnh. Một noãn có tPNa bình thường nhưng thiếu tống xuất PB2 gợi ý cho hiện tượng trinh sản [1].
• Hình thái thể tiền nhân (nucleolar procursor body, NPB) và tiếp hợp hai tiền nhân (pronuclear juxtaposition): Quá trình xếp hàng của các thể tiền nhân dọc theo vùng tiếp hợp của hai tiền nhân xảy ra sớm hơn đáng kể ở tiền nhân cái so với tiền nhân đực (8,2 ± 2,6 h vs. 11,2 ± 4,1 h, p = 0,0001). Ngoài ra, trường hợp hiếm gặp khi PN tiếp hợp bị dịch chuyển ra vỏ noãn, hiện tượng đẩy vỏ noãn có liên quan mạnh (p < 0,0001) với phân chia trực tiếp thành ba phôi bào ở lần phân bào đầu tiên - một dấu hiệu tiên lượng xấu chỉ phát hiện được qua TLM. Đồng thuận Istanbul 2025 (ESHRE/ALPHA) tiếp tục khuyến cáo đánh giá số lượng, phân bố và tính đối xứng của NPB như thông số tiên lượng chuẩn tại giai đoạn hợp tử [1].
• Khoảng thời gian giữa các sự kiện thụ tinh: Coticchio năm 2018 xác nhận rằng các khoảng thời gian giữa các sự kiện thụ tinh liên tiếp có liên quan chặt chẽ với chất lượng phôi ngày 3. Đặc biệt, khoảng thời gian kéo dài từ lúc quầng sáng bào tương (cytoplasmic halo) mờ dần đến khi tiền nhân tan biến (PN breakdown) là yếu tố dự đoán về tình trạng số lượng phôi bào giảm và mức độ phân mảnh tăng (p = 0,0001). Điều này chỉ có thể ghi nhận được qua TLM [8]. Nhận định này nhất quán với dữ liệu của Coticchio năm 2025, trong đó nhóm tPNf tối ưu (18-20 hpi) đạt tạo phôi nang cao nhất (65,4%), cao hơn đáng kể so với nhóm PN mờ sớm (≤16 hpi: 36,4%) và nhóm PN mờ muộn (>20 hpi: 53,3%) (p < 0,001) [4].
• Phát hiện 2.1PN: Nhóm 2.1PN gồm hai PN có kích thước bình thường và một vi tiền nhân (micro-pronucleus) có kích thước nhỏ. Nhóm này có tỷ lệ xuất hiện thấp nhưng có thể bị bỏ sót và phân loại nhầm thành nhóm 2PN bình thường khi quan sát hình thái tĩnh tại một thời điểm. Trong khi đó TLM với khả năng quan sát liên tục được kỳ vọng sẽ cải thiện độ chính xác nhận diện nhóm này, mặc dù bằng chứng trực tiếp vẫn đang được nghiên cứu. Đồng thuận Istanbul 2025 khuyến cáo việc sử dụng phôi từ nhóm 1PN và 2.1PN phải được thảo luận với bác sĩ lâm sàng, được quy định bởi chính sách nội bộ và chỉ nên cân nhắc sử dụng một cách thận trọng khi kết hợp với PGT-A để xác nhận tình trạng lưỡng bội có nguồn gốc từ bố mẹ (biparental diploidy) [1]

Kết luận

Đánh giá thụ tinh bằng quan sát hình thái tĩnh tại 16-18 hpi là phương pháp cơ bản có giá trị thực tiễn không thể phủ nhận. Tuy nhiên, do quá trình hình thành tiền nhân là một chuỗi sự kiện động học liên tục, một lần quan sát đơn lẻ mang những giới hạn cấu trúc không thể khắc phục dẫn đến nguy cơ phân loại sai ở các nhóm 0PN, 1PN (bằng chứng mạnh) và 2.1PN (bằng chứng còn hạn chế).

TLM vượt trội ở khả năng ghi nhận toàn bộ chuỗi sự kiện thụ tinh theo thời gian thực, đặc biệt có ý nghĩa lâm sàng trong ba tình huống: phân biệt 0PN thực sự với nhóm 2PN mờ sớm bị bỏ lỡ; xác nhận xuất hiện thể cực thứ hai và động học PN cho hợp tử 1PN ICSI trước khi sinh thiết PGT-A; và ghi nhận thời điểm tiền nhân mờ dần và hình thái thể tiền nhân (đây là các thông số có giá trị tiên lượng tỷ lệ hình thành phôi nang). Trong các tình huống này, TLM cung cấp thông tin không thể ghi nhận được bằng quan sát hình thái tĩnh, đóng vai trò quan trọng trong việc ra quyết định lâm sàng an toàn.

Đối với phòng lab chưa có TLM, các biện pháp thiết thực nhất gồm: tuân thủ khung giờ quan sát tối ưu (16-17 hpi), có thể bổ sung quan sát tại thời điểm muộn hơn để phát hiện các bất thường PN tiềm ẩn, và áp dụng PGT-A kết hợp SNP trước khi chuyển phôi từ nhóm PN bất thường nhằm xác định đầy đủ tình trạng lưỡng bội nguồn gốc từ cả bố và mẹ. Trong bối cảnh Đồng thuận Istanbul 2025 đã tích hợp dữ liệu động học hình thái từ TLM vào hệ thống khuyến cáo đánh giá phôi, và cho phép sử dụng có điều kiện phôi nang 0PN/1PN kết hợp PGT-A +SNP, TLM ngày càng trở thành công cụ thiết yếu để thực hiện đánh giá thụ tinh đầy đủ và an toàn.

1. The Working Group on the update of the ESHRE/ALPHA Istanbul Consensus , Giovanni Coticchio, Aisling Ahlström, Gemma Arroyo, Basak Balaban, Alison Campbell, Maria José De Los Santos, Thomas Ebner, David K Gardner, Borut Kovačič, Kersti Lundin, M Cristina Magli, Saria Mcheik, Dean E Morbeck, Laura Rienzi, Ioannis Sfontouris, Nathalie Vermeulen, Mina Alikani, The Istanbul consensus update: a revised ESHRE/ALPHA consensus on oocyte and embryo static and dynamic morphological assessment, Human Reproduction, Volume 40, Issue 6, June 2025, Pages 989–1035, https://doi.org/10.1093/humrep/deaf021

2. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting, Human Reproduction, Volume 26, Issue 6, 1 June 2011, Pages 1270–1283, https://doi.org/10.1093/humrep/der037

3. Kobayashi T, Ishikawa H, Ishii K, Sato A, Nakamura N, Saito Y, Hasegawa H, Fujita M, Mitsuhashi A, Shozu M. Time-lapse monitoring of fertilized human oocytes focused on the incidence of 0PN embryos in conventional in vitro fertilization cycles. Sci Rep. 2021 Sep 22;11(1):18862. doi: 10.1038/s41598-021-98312-1. PMID: 34552114; PMCID: PMC8458381.

4. Coticchio G, Taggi M, Asturi F, Stati A, Bordignon M, Innocenti F, Saturno G, Vaiarelli A, Rienzi L, Cimadomo D. Embryos not showing pronuclei by single static observation arise from atypical pronuclear dynamics or rare unfertilized oocytes with abortive cleavage behaviour. Hum Reprod. 2025 Dec 1;40(12):2286-2294. doi: 10.1093/humrep/deaf199. PMID: 41139421.

5. Mateo S, Vidal F, Parriego M, Rodríguez I, Montalvo V, Veiga A, Boada M. Could monopronucleated ICSI zygotes be considered for transfer? Analysis through time-lapse monitoring and PGS. J Assist Reprod Genet. 2017 Jul;34(7):905-911. doi: 10.1007/s10815-017-0937-z. Epub 2017 May 11. PMID: 28497410; PMCID: PMC5476548.

6. Mateo S, Vidal F, Carrasco B, Rodríguez I, Coroleu B, Veiga A, Boada M. Morphokinetics and in vitro developmental potential of monopronucleated ICSI zygotes until the blastocyst stage. Zygote. 2020 Jun;28(3):217-222. doi: 10.1017/S0967199420000027. Epub 2020 Mar 11. PMID: 32156320.

7. Lee T, Qi F, Peirce K, Natalwala J, Chapple V, Mark PJ, Sanders K, Liu Y. To discard or not to discard 1PNs? A systematic review and meta-analysis on 291,474 embryos. Reprod Biomed Online. 2026 Feb;52(2):105080. doi: 10.1016/j.rbmo.2025.105080. Epub 2025 Jun 3. PMID: 41330859.

8. Coticchio G, Mignini Renzini M, Novara PV, Lain M, De Ponti E, Turchi D, Fadini R, Dal Canto M. Focused time-lapse analysis reveals novel aspects of human fertilization and suggests new parameters of embryo viability. Hum Reprod. 2018 Jan 1;33(1):23-31. doi: 10.1093/humrep/dex344. PMID: 29149327.